BioCheck，Inc。為醫(yī)療保健市場(chǎng)和研究市場(chǎng)開發(fā)，制造和分銷免疫診斷檢測(cè)試劑盒和研究試劑。

我們的新產(chǎn)品包括用于研究應(yīng)用的兔單克隆抗體，用于小鼠和人類Id1，Id2，Id3和Id4蛋白，抗體用于HMGA2的研究應(yīng)用。

BioCheck bc-1301說明書

PD-1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT

pd-1酶免疫測(cè)定試劑盒

Enzyme Immunoassay for the Quantitative Determination of PD-1 Concentration in Human Serum and Plasma

酶免疫法定量測(cè)定人血清和血漿中Pd-1濃度

目錄編號(hào)：bc-1301

只作研究用途，而非用于診斷程序。

介紹

程序性細(xì)胞死亡蛋白1(pd-1，CD 279，pdd 1)是一種細(xì)胞表面受體，對(duì)調(diào)節(jié)T細(xì)胞炎癥活動(dòng)和維持外周免疫耐受至關(guān)重要。 系統(tǒng)(1)。pd-1可以與配體pd-l1和pd-l2相互作用。pd-1具有胞外IGV結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和帶有兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)(shp-1和shp-2)的胞內(nèi)尾。 下調(diào)免疫系統(tǒng)，抑制T細(xì)胞活性(2)。抗原識(shí)別后，活化的T細(xì)胞在其表面表達(dá)pd-1，產(chǎn)生干擾素，誘導(dǎo)P的表達(dá)。 d-L1，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡。(3)當(dāng)pd-1配體被腫瘤細(xì)胞劫持時(shí)，其異常表達(dá)抑制了免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，導(dǎo)致疾病進(jìn)展。 <物>離子 (4).

血清和血漿中Pd-1水平升高與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和皮膚硬化有關(guān)(5，6)。Pd-1主要由腫瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞(7)表達(dá).進(jìn)一步再 研究表明，使用針對(duì)pd-1免疫檢查點(diǎn)的單克隆抗體有助于在理解和治療黑色素瘤和其他內(nèi)翻等癌癥方面取得突破性進(jìn)展。 非小細(xì)胞肺癌(4)。

測(cè)定原理

pd-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是以固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為基礎(chǔ)的.該檢測(cè)系統(tǒng)利用一種*的單克隆抗體對(duì)，針對(duì)一種*的抗原性測(cè)定方法。 Pd-1分子上的螞蟻。用一種小鼠抗PD-1單克隆抗體進(jìn)行固相固定(在微滴度井上).另一種與辣根結(jié)合的單克隆抗pd-1抗體 H過氧化物酶(HRP)存在于酶的共軛溶液中。測(cè)試樣品被允許與這兩種抗體順序反應(yīng)，導(dǎo)致pd-1分子被夾在固體p之間。 Hase和酶聯(lián)抗體。在室溫下進(jìn)行兩次單獨(dú)的60分鐘孵育后，用洗滌緩沖液沖洗水井，除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體。TMB試劑添加了一個(gè) ND在黑暗條件下孵育20分鐘，形成藍(lán)色。隨著停止解決方案的添加，顏色開發(fā)停止，將顏色更改為黃色。這，這個(gè)，那，那個(gè) Pd-1濃度與樣品的顯色強(qiáng)度成正比.在450 nm處分光度法測(cè)定吸光度。

試劑準(zhǔn)備

所有試劑在使用前應(yīng)允許達(dá)到室溫(18-25°C)。

2.對(duì)于每次測(cè)試運(yùn)行，準(zhǔn)備一個(gè)新的標(biāo)準(zhǔn)集。

3.用標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋劑稀釋50~10 ng/mL。用標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋劑制備10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)的雙倍系列稀釋劑：

a.10 ng/mL：0.12mL 50 ng/mL，0.48mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑b。5 ng/mL：0.25mL 10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑c。2.5納克/毫升：0.25毫升5納克/毫升標(biāo)準(zhǔn)品/樣品 稀釋劑d.1.25 ng/mL：0.25 mL，2.5 ng/ml，0.25 mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑e。0.625 ng/mL：1.25ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑f的0.25ng/mL。0.313 ng/mL：0.25mL，0.625 ng/mL 0。 25 mL標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋劑

h.0.156 ng/mL：0.25mL，0.313 ng/mL，0.25mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑I。0 ng/mL：0.25 mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑

病人樣本在使用前需要稀釋4倍。制備一系列小管(即1.5 mL微離心管)，將60L血清與180 L標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋劑混合。

6.工作洗滌緩沖器：從20倍庫(kù)存中制備1倍洗滌緩沖液。加入50毫升的20倍洗滌緩沖液庫(kù)存到950毫升的直接水。工作洗滌緩沖液在2~8°C溫度下穩(wěn)定運(yùn)行30天.注：任何水晶 由于高鹽濃度而可能出現(xiàn)的S，必須在室溫下重新溶解，然后再進(jìn)行稀釋。

檢測(cè)程序

準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)。見試劑準(zhǔn)備。

稀釋樣品1：4稀釋。見試劑準(zhǔn)備。

確保所需數(shù)量的涂層井在保持架。

配發(fā)Pd-1標(biāo)準(zhǔn)的100mL，并將樣品稀釋到適當(dāng)?shù)木?

室溫(18-25°C)孵育60 min.

將培養(yǎng)皿中的內(nèi)容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把水井打到吸水性紙或吸塵器上。 用毛巾去除所有殘留的水滴。

將Pd-1工作酶結(jié)合劑的100mL配伍到每口井中.

8.室溫(18-25°C)孵育60 min.

9.將培養(yǎng)皿中的內(nèi)容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把水井打到吸收紙上或 紙巾去除所有殘留水滴。

10.在每口井中分配100mL TMB溶液。

11.室溫(18-25°C)孵育20分鐘.

12.通過在每口井中加入100mL的停止溶液來停止反應(yīng)。

13.輕輕攪拌30秒。重要的是要確保所有的藍(lán)色*變成黃色。

14.在450 nm處讀取吸光度，15分鐘內(nèi)使用微滴度良好的閱讀器。

統(tǒng)計(jì)

計(jì)算每組參考標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照和樣品的平均吸光度值(OD 450)。

通過繪制每個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度(以納克/毫升為單位)繪制在圖表紙上，并在垂直(Y)軸上繪制吸光度，從而構(gòu)造一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在水平(X)軸上的比率。

用每個(gè)樣品的平均吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上測(cè)定相應(yīng)的Pd-1濃度(ng/mL)。取決于經(jīng)驗(yàn)和/或計(jì)算機(jī)的可用性 能力，可以采用其他的數(shù)據(jù)縮減方法。

4.樣品的檢出值應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)為4，得到Pd-1的結(jié)果為ng/ml。

標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)例

一個(gè)典型的標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行結(jié)果，吸光度讀數(shù)在450 nm處顯示在Y軸上，而pd-1濃度顯示在X軸上。注：本標(biāo)準(zhǔn)曲線為圖示目的。 僅用于計(jì)算未知數(shù)，不應(yīng)用于計(jì)算未知數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室必須在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中生成自己的數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

工作特性

從零標(biāo)準(zhǔn)的平均值用2SD法測(cè)定的Pd-1ELISA低可檢出濃度為0.15ng/ml。

精度a.在一次測(cè)定中，通過對(duì)三種不同樣品的重復(fù)測(cè)定，確定了內(nèi)測(cè)精密度.批內(nèi)可變性如下所示：

b. 在一系列單獨(dú)校準(zhǔn)的測(cè)試中，通過對(duì)三個(gè)不同樣本的重復(fù)測(cè)量，確定了運(yùn)行間精密度。試驗(yàn)間的可變性顯示為貝爾。 表示突然疼痛所發(fā)出的聲音

3、回收率和線性研究。回收樣品加入已知的Pd-1水平，并一式兩份進(jìn)行測(cè)定。平均回收率為105.3%。

b.對(duì)三個(gè)樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，以確定線性度。平均回收率為99.6%。

REFERENCES

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7. Ahmadzadeh, M., Johnson, L. A., Heemskerk, B., Wunderlich, J. R., Dudley, M. E., White, D. E., & Rosenberg, S. A. (2009). Tumor antigen–specific CD8 T cells infiltrating the tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired. Blood, 114(8), 1537–1544

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