淋巴細(xì)胞分離簡述

     作為一種重要的免疫細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的數(shù)目及功能狀態(tài)反應(yīng)了機體所處的免疫狀態(tài)，與一些先天或后天的免疫缺陷性疾病、傳染性疾病以及惡性腫瘤等免疫功能障礙有關(guān)的疾病有密切關(guān)聯(lián)。因此，研究淋巴細(xì)胞的免疫狀態(tài)對多種疾病的診斷、預(yù)防及治療都有著極為重要的意義。而淋巴細(xì)胞分離是研究淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)及其在細(xì)胞免疫中作用的關(guān)鍵步驟。

淋巴細(xì)胞分離來源主要是外周血（或淋巴組織細(xì)胞懸液），目前常規(guī)的淋巴細(xì)胞分離方法有基于淋巴細(xì)胞分離液的密度梯度離心法、HES沉降法、以及基于抗原抗體結(jié)合的磁珠與流式細(xì)胞分離法。本文就現(xiàn)在常用的幾種淋巴細(xì)胞分離方法及其特點做一簡要綜述。

1、密度梯度離心法

該方法采用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行進(jìn)行密度梯度離心分離得到淋巴細(xì)胞。外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同從而導(dǎo)致各種細(xì)胞具有不同的密度，淋巴細(xì)胞分離液即是一種根據(jù)細(xì)胞密度差異，借助離心產(chǎn)生的重力加速度，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離純化的常用試劑。常用的淋巴細(xì)胞分離液有Ficoll淋巴細(xì)胞分離液和Percoll淋巴細(xì)胞分離液。

1.1. Ficoll-Hypaque密度梯度離心法

Ficoll是一種中性的蔗糖的多聚體，吸水性強，平均分子量為400,000，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點。單一的Ficoll溶液分子量大，高濃度時增加粘度易導(dǎo)致細(xì)胞聚集，因此常用的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液采用了降低Ficoll濃度，同時加入泛影葡胺增加密度的Ficoll-Hypaqu混合溶液，其密度在1.077左右，近于等滲，適用于分離外周血淋巴細(xì)胞和單個核細(xì)胞（PBMC，外周血淋巴細(xì)胞和單個核細(xì)胞比重為1.075左右）^【1】。利用該分離液作密度梯度離心時，各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集，紅細(xì)胞與粒細(xì)胞由于密度較大故沉于分層液的底部，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（PBMC）的比重與分層液比重相近，故位于分層液界面上。^【2，3】

 Ficool淋巴細(xì)胞分離液是一種經(jīng)典的淋巴細(xì)胞分離試劑，分離得到的PBMC純度在90％以上，收獲率可達(dá)80～90％，活細(xì)胞百分率在95％以上。然而因其固定的密度，故只適用于PBMC、脊髓干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞的分離。

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供應(yīng)商               品名                    貨號        規(guī)格

MP Biomedicals   Lymphocyte Separation Medium - LSM™  0850494X    100 mL  

biomarket       LymphoprepTM分離液          1114544      250ml

1.2. Percoll密度梯度離心法：

Percoll成分為硅化聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的顆粒，滲透壓很低，粘度也很小，不穿透生物膜，對細(xì)胞無毒害無刺激，不引起細(xì)胞聚集，可形成高達(dá)1.3g／ml密度。特別的是percoll的顆粒直徑大小不同，可在離心過程中自然形成連續(xù)的密度梯度，從而將不同密度的細(xì)胞分離出來。而且Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定，配置不同濃度（密度）時僅需通過用PBS(1x)或組織培養(yǎng)液稀釋即可獲得，廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。采用Percoll細(xì)胞分離液得到的細(xì)胞可直接用于基于熒光標(biāo)記的細(xì)胞分選。^【4】

因此，Percoll細(xì)胞分離液不僅適用于外周血中PBMC的分離（單個核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分別處于不同的密度層），而且能將全血中的多種細(xì)胞分離出來（各種細(xì)胞處于相應(yīng)的梯度層），還可根據(jù)不同實驗室需要配置所需的連續(xù)密度梯度，分離特定的細(xì)胞或亞細(xì)胞組分。初步分離得到的PBMC可根據(jù)需要不同密度梯度的不連續(xù)梯度離心方法進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)胞純化，如純化淋巴母細(xì)胞和除去死細(xì)胞以及富含NK活性大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)的純化。^【5】

常用percoll濃度密度換算（Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9：1的比例混合，此時溶液 為100％ Percoll，比重是1.127）

Percoll濃度(％)    70       60       50       40       30        20 

比重g／ml       1.090  1.077    1.067   1.056   1.043     1.031

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供應(yīng)商    貨號           規(guī)格

GE    17-0891-01         1 L

GE    17-0891-01         100 ml

1.3. Iodixanol梯度離心法

Iodixanol是一種化學(xué)成分為碘海醇（Iohexo1）的白色、高親水性粉劑，可以配成型的非離子密度梯度分離液。分子量為821，密度為2.1 g/ml，是非離子型的、對細(xì)胞無毒性的化合物，可用于細(xì)胞、細(xì)胞器、生物大分子、病毒等各種生物物質(zhì)的分離或提純^【6】。該分離液的密度可以通過測定其折射率來確定，配置后可以進(jìn)行高溫高壓的滅菌。可根據(jù)需要配置成不同密度的梯度離心液，主要用于脂蛋白的分離，也可用于淋巴細(xì)胞分離純化。^【7,8】

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供應(yīng)商              品名                        貨號           規(guī)格

Axis-Shield      Nycodenz（粉劑）         AS1002424      1x500g

Axis-Shield  LymphoprepTM  分離管（即用型）   AS1019818    18Tubes x10ml

Axis-Shield   OptiPrepTM  分離液（即用型）AS1114542      1x250ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分離液（即用型）AS1114544    1x250ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分離液（即用型）AS1114545    4x250ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分離液（即用型）AS1114547    1x500ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分離液（即用型）AS1114547     6x500ml

Axis-Shield  NycoPrepTM 1.077  分離液（即用型）AS1114550  4x250ml

Axis-Shield  NycoPrepTM 1.077  分離液（即用型）AS1114551   1x250ml

2、羥*基淀粉（HES）離心沉淀法

HES是一種由高分子量支鏈淀粉經(jīng)降解、羥*基化并進(jìn)一步加工處理后制成的血漿代用品^【9】。自然狀態(tài)下，HES與紅細(xì)胞膜上的負(fù)電荷結(jié)合，使紅細(xì)胞彼此以凹面相貼聚集而下沉，與血漿及單個核細(xì)胞形成清晰的界面。如果HES與外周血混合物經(jīng)低速離心可加快紅細(xì)胞的下沉，便于吸取含單核細(xì)胞層，使PBMC的分離過程簡單化。該方法分離PBMC操作簡便，成本低廉，分離細(xì)胞數(shù)量與密度梯度離心方法相當(dāng)。然而該方法分離的細(xì)胞質(zhì)量有待進(jìn)一步提高。^【10-12】

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國內(nèi)多家血漿代用品供應(yīng)商如湖北武漢康寶泰精細(xì)化工有限公司可以獲得。

3、基于免疫技術(shù)的淋巴細(xì)胞分離法

目前多家生物制品公司均開發(fā)出的基于抗原抗體特異性結(jié)合的淋巴細(xì)胞分離試劑盒，主要有免疫磁珠分離法、流式細(xì)胞分選法^【13,14】。這些試劑盒能特異性分離外周血或其它組織中的單一淋巴細(xì)胞類型，操作簡便，所得細(xì)胞純度高，可直接用于下游分子生物學(xué)實驗。然而該法基于抗體技術(shù)，因此成本高，還未成為目前的主流淋巴細(xì)胞分離方法。

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供應(yīng)商              品名                              貨號

Stem cell   EasySep™ Magnet全淋巴細(xì)胞富集試劑盒    19961HLA

Stem cell   EasySep™ MagnetT細(xì)胞富集試劑盒         19951HLA

Stem cell   EasySep™ MagnetB細(xì)胞富集試劑盒         19954HLA

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主要參考文獻(xiàn)：

1. Separation of human lymphocytes from citrated blood by density gradient (NycoPrep) centrifugation: monocyte depletion depending upon activation of membrane potassium channels. Bøyum A, Brincker Fjerdingstad H, Martinsen I, Lea T, Løvhaug D. Scand J Immunol. 2002 Jul;56(1):76-84.

2. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Bøyum A, Løvhaug D, Tresland L, Nordlie EM. Scand J Immunol. 1991 Dec;34(6):697-712.

3. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Bøyum A.

Scand J Immunol. 1976 Jun;Suppl 5:9-15.

4. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. de Almeida MC, Silva AC, Barral A, Barral Netto M. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3

5. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.

Pino PA, Cardona AE. J Vis Exp. 2011 Feb 2;(48). pii: 2348.

Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3.

6. Iodixanol梯度離心法分離脂蛋白. 黨美林，林元喜. 《第七屆海峽兩岸心血管科學(xué)研討會論文集》.2009年 

7. Su-Ting Chen, Jia-Yun Li, Yi Zhang. Recombinant MPT83 Derived from Mycobacterium tuberculosis Induces Cytokine Production and Upregulates  the Function of Mouse Macrophages through TLR2. The Journal of Immunology, 2012, 188: 668–677

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14. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Dagur PK, McCoy JP Jr. Curr Protoc Cytom. 2015 Jul 1;73:5.1.1-5.1.16