phiphilux泛毒素

概述

泛毒素^™ 是 OncoImmunin,Inc. 新的基于活細(xì)胞的試劑盒，用于測量細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞打擊的致死物成功遞送到單個(gè)靶細(xì)胞。該試劑盒用于具有雙激光（488 和 633 nm）細(xì)胞計(jì)數(shù)能力的 80 次測定。（對于單激光系統(tǒng)，請聯(lián)系 OncoImmunin,Inc.直接。）

泛毒素^™ 與格蘭毒素^®加！和CyToxiLux^®加！、OncoImmunin,Inc. 的其他單細(xì)胞毒性檢測試劑盒，區(qū)別在于細(xì)胞滲透性、熒光底物：泛毒素^™ 含有可檢測兩者顆粒酶 B 和上游半胱天冬酶活性，而底物在格蘭毒素^® 旨在僅檢測顆粒酶 B 活性，并在CyToxiLux^® 下游半胱天冬酶活性。與其他兩個(gè)套件一樣，泛毒素^™ 可用于操作抗體的選擇通過an 抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADCC)低通量和高通量篩選 (HTS) 模式下的機(jī)制。

優(yōu)點(diǎn)泛毒素^™, 格蘭毒素^®和CyToxiLux^® 超過其他細(xì)胞毒性試驗(yàn)，例如，⁵¹Cr 釋放、LDH 釋放和 PI 包括：(1) 細(xì)胞毒性作為導(dǎo)致細(xì)胞死亡（細(xì)胞滲透性熒光底物裂解）的基本生化途徑進(jìn)行測定，而不僅僅是質(zhì)膜滲透性損失及其后遺癥，(2) 敏感性增強(qiáng)，可檢測到針對亞優(yōu)勢表位的相對較弱 CTL 反應(yīng) (3) 快速性（效應(yīng)子：目標(biāo)共孵育時(shí)間為 0.3-2 小時(shí)），(4) 可通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡僅在靶細(xì)胞群中進(jìn)行細(xì)胞死亡測定，(5) 結(jié)合免疫表型分析和多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)時(shí)，可直接觀察和監(jiān)測細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的主要宿主靶細(xì)胞殺傷以及效應(yīng)細(xì)胞的生理和命運(yùn)。

靶細(xì)胞被熒光標(biāo)記（紅色）然后在有熒光的情況下與細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞共孵育底物。孵育和清洗后，可通過流式細(xì)胞儀分析樣本。裂解底物  導(dǎo)致死亡細(xì)胞中綠色熒光增加。實(shí)時(shí)成像也可以用共聚焦顯微鏡進(jìn)行。

請?jiān)陂_始試驗(yàn)前閱讀整個(gè)方案！

組件供應(yīng)泛毒素^™ 試劑盒（足夠用于 80 含量測定） 由以下機(jī)構(gòu)提供的組件 使用者

小瓶 PS（4 瓶）=PanCyToxiLux^™ 底物 溶液 效應(yīng)子 細(xì)胞

小瓶 TFL4（1 瓶）=靶細(xì)胞與雙激光儀器配合使用的標(biāo)記物 TFL 稀釋介質(zhì)（1 個(gè)小 Eppendorf 管）= 重懸介質(zhì)

針對小瓶 TFL4

靶細(xì)胞

清洗緩沖液瓶（1 瓶）

為了從起始靶細(xì)胞群中消除非活細(xì)胞，例如，由于凍融循環(huán)，請聯(lián)系 OncoImmunin,Inc.請注意：用熒光探針標(biāo)記細(xì)胞表面是不推薦，因?yàn)檫@可能干擾效應(yīng)物-靶標(biāo)相互作用。當(dāng)按照本文中的程序使用時(shí)，TFL4 確實(shí)不標(biāo)記細(xì)胞表面。

格式：可使用 96 孔板或聚丙烯微量離心管進(jìn)行試驗(yàn)。

TFL4 的復(fù)溶：從小 Eppendorf 管中取 25<unk>l 加入小瓶 TFL4。（復(fù)溶后，TFL4應(yīng)儲(chǔ)存在-20^oC.)

中 T= 標(biāo)記靶細(xì)胞的培養(yǎng)基。復(fù)溶溶液 1<unk>lTFL4加入靶細(xì)胞生長的培養(yǎng)基或生理緩沖液如磷酸鹽緩沖液 (PBS) 中。請注意：大多數(shù)細(xì)胞在 PBS 或不含血清的培養(yǎng)基中負(fù)荷更有效。如含 10% 血清，推薦TFL4稀釋度為 1:1000，而對于無血清緩沖液，靶細(xì)胞標(biāo)記通常用于1:3000但是，進(jìn)一步稀釋可能更優(yōu)。宜TFL4單個(gè)靶細(xì)胞類型的濃度應(yīng)確定為 1:1000（含血清）和 1:3000（無血清培養(yǎng)基）僅為建議的起始點(diǎn)。

洗滌定義為加入體積的培養(yǎng)基/緩沖液，然后離心，然后小心移除試管中的所有液體或輕彈，然后輕輕夯實(shí)平板。應(yīng)使用手指輕輕移液和/或輕敲試管，重懸微丸。請勿渦旋.

方案

制備靶細(xì)胞

1. 懸浮靶細(xì)胞（懸浮或胰蛋白酶化貼壁細(xì)胞）于中 T在 2 x 10⁶細(xì)胞/ml。（這是建議的濃度。可以并常規(guī)使用較低的數(shù)字。臨界點(diǎn)是能夠收集到 2,000-10,000  分析用靶細(xì)胞（見下文）。）如果要用增敏劑（如多肽）沖擊靶標(biāo)，則應(yīng)在此階段加入后者。（如果肽溶解度需要使用有機(jī)助溶劑，后者不應(yīng)超過 0.3% (v/v)，且 溶媒

207A Perry Parkway,Suite 6 V: 301-987-7881 cytotoxicity@PhiPhiLux.com

Gaithersburg,MD 20877 F: 301-987-7882 www.cytotoxicity。。ｃｏｍ

應(yīng)包括對照管/孔。）在 37 ℃ 下孵育^oC 下 0.25-1.0 小時(shí)。應(yīng)確定單個(gè)細(xì)胞類型（和致敏劑）的宜時(shí)間。請注意：對于 PBL 的上樣，1:1000 稀釋TFL4在 37℃PBS 中 15'^o建議使用 C。如果要將多肽與靶標(biāo)一起使用，建議是添加TFL4對于后 15’ 的致敏劑暴露。

1. 在此期間，制備效應(yīng)細(xì)胞（見下文）。
2. 清洗靶細(xì)胞2 次，至少超出生理體積的 10 倍每次清洗的緩沖液/培養(yǎng)基.
3. 標(biāo)示計(jì)數(shù)靶細(xì)胞。（此時(shí)必須對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，因?yàn)榍逑磿r(shí)始終存在細(xì)胞損失。）重懸標(biāo)記靶細(xì)胞在 1 x 10 下⁶細(xì)胞/ml清洗緩沖液。（根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，較低濃度的靶細(xì)胞可使用。1 x 10⁶對于 1 x 10 的情況，建議使用 cells/ml⁵ 目標(biāo)/孔或  管將為 使用。）
4. 分配 100<unk>l靶細(xì)胞混懸液加至各試驗(yàn)孔或試管中。

效應(yīng)細(xì)胞的制備

1.  制備適當(dāng)濃度的效應(yīng)細(xì)胞清洗緩沖液.   例如，對于終效應(yīng)者目標(biāo)比值  的 5:1，其中 1 x 10⁵ 目標(biāo)/孔或管將使用，以 5 x 10 懸浮效應(yīng)細(xì)胞⁶ 細(xì)胞/ml。

共孵育目標(biāo)和效應(yīng)細(xì)胞

1. 向各孔或含以下物質(zhì)的試管中加入 100<unk>l 效應(yīng)細(xì)胞懸液靶細(xì)胞除外至少兩個(gè)孔，并加入 100

<unk>l 效應(yīng)細(xì)胞懸液至至少兩個(gè)不含靶細(xì)胞.

1. 加入 100<unk>l清洗緩沖液至僅含目標(biāo)且僅效應(yīng)物使所有樣品達(dá)到終體積 200<unk>l.
2. 離心所有樣品，小心移除培養(yǎng)基，并將細(xì)胞團(tuán)塊重懸于 75<unk>l 中底物來自小瓶 PSor 清洗緩沖液對于對照品（不存在底物（適用于以下管 A 和 C）。對于 ADCC，抗體應(yīng)添加至  這次。
3. 重懸后，立即通過短暫離心沉淀細(xì)胞（一旦離心機(jī)達(dá)到細(xì)胞正常使用的速度，保持 30 秒，然后停止儀器。）
4. 在 37 ℃ 下孵育^oC 為所需時(shí)間點(diǎn)。由于該試驗(yàn)檢測的是瀕死細(xì)胞，而不是具有不可逆損傷質(zhì)膜的細(xì)胞，因此給定細(xì)胞系統(tǒng)的孵育時(shí)間（以及 E:T）應(yīng)顯著短于（和低于）其他方法。對于單個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定，建議的共孵育時(shí)間為 1 小時(shí)（終端用戶時(shí)間通常在 30 min 至 2 小時(shí)之間）。相當(dāng)長的時(shí)間不會(huì) 推薦。
5. 用 200<unk>l 清洗各樣品清洗緩沖液.
6. 重懸各樣品清洗緩沖液，如果使用酶標(biāo)儀，轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀試管中或留在平板中，并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

樣品總結(jié)：

1. 靶細(xì)胞（= 靶細(xì)胞 TFL4）
2. 靶細(xì)胞+ 底物來自小瓶 PS
3. 效應(yīng)細(xì)胞
4. 效應(yīng)細(xì)胞 +底物來自小瓶 PS
5. 靶細(xì)胞+ 效應(yīng)細(xì)胞 +底物來自小瓶 PS（多個(gè)樣本）

流式細(xì)胞術(shù)：請勿渦旋。  (N.B.：由于本試驗(yàn)測量的是致死打到靶細(xì)胞渦旋  強(qiáng)烈建議不要使用。）

應(yīng)使用與以下激發(fā)和發(fā)射峰一致的通道設(shè)置：

TFL4l_ex: 633 nm, l_em: 657 nm

PS l_ex: 488 nm, l_em: 520 nm

對于為特定探針設(shè)置軟件的儀器：APC針對TFL4和FITC針對PS.

1. 在 FSC 點(diǎn)圖上（x 軸）vs. SSC（y 軸），位置靶細(xì)胞（樣本 A）位于右下方并抽取門控 1如下所示（此門控用于刪除無細(xì)胞事件）：

1. 使用樣品A 和D 初始設(shè)置APC（用于TFL4）和FITC（用于泛毒素^™）通道，resp.：放置樣品中細(xì)胞的峰值A 接近 10³在APC通道和樣品峰D at ca. 10¹在FITC通道。樣品 B 中的細(xì)胞應(yīng)位于ca. 10³在APC和 10¹在FITC通道，如下所示。可通過樣品 B 的 PMT 小幅調(diào)整進(jìn)行優(yōu)化（注：健康（臺(tái)盼藍(lán)拒染法顯示 > 95% 活性）TFL4-標(biāo)記靶細(xì)胞應(yīng)顯示為單一群體。如果不是，首先嘗試將貼標(biāo)時(shí)間縮短至 15 min。如果仍存在一個(gè)以上的種群，則減少TFL4 濃度。）

運(yùn)行剩余樣本。2,000-10,000靶細(xì)胞應(yīng)采集每份樣本進(jìn)行分析門 2（上圖和下圖）。門 2應(yīng)嵌套在內(nèi)部門控 1。在以下 E:T (NK92:K562) 為 3:1 的示例中，能夠裂解 PanToxiLux 的靶細(xì)胞百分比^™底物is 70.3%。這與 4.8%靶細(xì)胞單獨(dú)的背景（如上圖所示）。請注意：使用 NFL1（OncoImmunin,Inc. 提供的探針）可顯著降低該背景。需要帶有 PacBlue 通道的細(xì)胞儀（激發(fā)ca. 405 nm 和發(fā)射ca. 465 nm).

參考文獻(xiàn)泛毒素™

1. B.Z. Packard、W.G. Telford、A. Komoriya 和 P.A. Henkart。靶細(xì)胞中的顆粒酶 B 活性可檢測細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的攻擊。J. Immunol.179:3812- 3820 (2007).
2. A. Kinter、J. McNally、L. Riggin、R. Jackson、G. Roby 和 A.S. Fauci。淋巴結(jié) CD25 抑制 HIV 特異性 T 細(xì)胞活性+ HIV 感染者的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞。PNAS104:3390-3395 (2007).
3. T. Tarasenko、H.K. Kole、A.W. Chi、M.M. Mentink-Kane、T.A. Wynn 和 S. Bolland。肌醇磷酸酶 SHIP 的 T 細(xì)胞特異性缺失揭示了其在調(diào)節(jié) Th1/Th2 和細(xì)胞毒性反應(yīng)中的作用。PNAS104(27):11382-11387 (2007).
4. M. Carlsten,N.K. BjörkströM,H. Norell,等人。DNAX 輔助分子-1 介導(dǎo)靜息自然殺傷細(xì)胞識別新鮮分離的卵巢癌。癌癥研究67: 1317-1325 (2007).
5. A.L. Kinter、R. Horak、M. Sion，等人. CD25+ 從 HIV 感染者分離的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞抑制 HIV 特異性 CD8 + T 細(xì)胞的溶細(xì)胞性和非溶細(xì)胞性抗病毒活性體外. AIDS 研究和人類逆轉(zhuǎn)錄病毒23:438-450 (2007).
6. R. Chiarle、C. Martinengo、C. Mastini、C. Ambrogio、V. D’Escamard、G. Forni 和 G. Inghirami。間變性淋巴瘤激酶是淋巴瘤疫苗接種的有效癌抗原。國家中位數(shù)14:676-80 (2008).
7. A. Singh、H. Nie、B. Ghosn、H. Qin、L.H. Kwak 和 K. Roy。通過雙模式、單載體將細(xì)胞因子靶向 siRNA 和 DNA 疫苗遞送至抗原呈遞細(xì)胞，有效調(diào)節(jié) T 細(xì)胞應(yīng)答。摩爾治療16:2011-2021 (2008).
8. S.A. Migueles,C.M Osborne,C. Royce等人。與免疫控制相關(guān)的 HIV 感染細(xì)胞消除需要 CD8 + T 細(xì)胞的溶解性顆粒負(fù)荷。

抗擾度29:1009-21.